Circa la metà dei pazienti con cardiopatia congenita (CHD) sono portatori di varianti genetiche potenzialmente dannose. Eppure nella maggior parte dei casi manca un'associazione definitiva per una data mutazione alla malattia, così come manca una comprensione del tipo o dei tipi cellulari interessati e del meccanismo sottostante. Questi aspetti limitano notevolmente l'utilità dei test genetici e lo sviluppo di terapie mirate. C'è, pertanto, una necessità critica di annotare funzionalmente il ruolo di un elenco crescente di geni candidati per CHD. Lo sviluppo e la convalida di modelli rapidi, scalabili e predittivi di CHD è quindi fondamentale. In questa luce, ipotizziamo che la malformazione nello sviluppo del cuore possa essere prevista in modo efficiente mediante l'analisi firme trascrizionali nei progenitori cardiaci. La nostra indagine ha due obiettivi centrali. In primo luogo, definiremo in modo completo i ruoli specifici del lignaggio dei geni associati a CHD impiegando un nuovo approccio di screening raggruppato fenotipo-agnostico chiamato OPTiKD-seq. Questo metodo utilizza il sequenziamento dell'RNA unicellulare (scRNA-seq) per deconvolvere gli effetti globali di perturbazioni di perdita di funzione in cellule derivate da cellule umani staminali pluripotenti indotte (hiPSC). Esamineremo 132 geni in tre chiavi lignaggi cardiaci: il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF) e le cellule endocardiche (EC). Svilupperemo quindi un “atlante della funzione dei geni coinvolti in CHD”, identificando i percorsi critici coinvolti nella patogenesi della malattia. In secondo luogo, illustreremo i ruoli morfogenetici dei geni candidati associati alle CHD. Lo faremo utilizzando nuovi organoidi cardiaci (cardioidi) auto-organizzanti derivati dall'hiPSC che formano camere con rivestimento EC e che modellano FHF o SHF. Useremo CRISPR/Cas9 per generare un reporter fluorescente trilineare hiPSC, consentendo ai saggi di morfometria ad alto rendimento di studiare almeno dieci geni candidati. Infine, riprodurremo i risultati chiave utilizzando lo sviluppo di embrioni ed espianti di pollo per stabilire il valore predittivo dei cardioidi umani nella modellazione di CHD e nell'annotazione funzionale dei geni CHD candidati. Collettivamente, questo progetto svilupperà una pipeline innovativa per studiare la CHD in modo efficiente attraverso il confronto di firme trascrizionali e morfogenetiche nei modelli hiPSC 2D e 3D, rispettivamente, e convalidando risultati in vitro in vivo. I nostri risultati genereranno anche conoscenze con rilevanza clinica immediata (per esempio test genetici) e forniranno la base per lo sviluppo razionale e il test di terapie personalizzate per CHD.