Analisi via spettrometria di massa di molecole Quorum Sensing in pazienti con shock settico e loro ruolo nello sviluppo di danno renale acuto.
ProgettoIl progetto proposto riguarda la quantificazione via spettrometria di massa di molecole di origine batterica in campioni biologici di pazienti con shock settico. L’iniziativa vuole infatti soddisfare il bisogno di valutare la presenza delle molecole note come Quorum Sensing (QS) come bio-marcatori in pazienti critici ricoverati in terapia intensiva e sub-intensiva con shock settico in tempi differenti.
Il progetto è caratterizzato dalla capacità di creare una proficua rete a livello territoriale sfruttando le diverse competenze chimico-analitiche e cliniche dei componenti. Grazie alla disponibilità della strumentazione e delle competenze del laboratorio dell’unità di spettrometria di massa, Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute dell’Università di Torino (Dal Bello / Medana) per la quantificazione di molecole di origine batteriche di interesse biologico e alle profonde conoscenze cliniche in ambito anestesiologico e nefrologico delle unità dell’Università degli Studi di Torino, Dipartimento di Scienze Chirurgiche (Fanelli) e dell’Università degli Studi del Piemonte Orientale, Dipartimento di Medicina Traslazionale (Cantaluppi), il progetto di propone di realizzare uno studio prospettico osservazionale sul territorio Piemontese dell’evolversi dello shock settico in danno renale acuto (Acute Kidney Injury AKI).
L’integrazione interdisciplinare delle attività della ricerca in campo chimico-analitico e delle azioni della pratica clinica è un bisogno fondamentale per l’individuazione di bio-marcatori molecolari. La spettrometria di massa è una tecnica potente e di alta significatività diagnostica che è recentemente stata introdotta in molteplici determinazioni diagnostiche in ambito clinico. A seguito di ricerche innovative condotte con l’utilizzo della spettrometria di massa, è stato possibile individuare e studiare le molecole QS che veicolano informazioni che i germi si scambiano e possono indurre danno renale acuto (Acute Kidney Injury AKI). I QS rappresentano un sistema di regolazione trascrizionale dipendente dalla densità cellulare e costituiti da due elementi: molecola segnale in grado di essere internalizzata a livello citoplasmatico e attivatore trascrizionale. Chimicamente i QS possono essere descritti come piccole molecole in grado di diffondere nei fluidi biologici e sono rappresentati da oligopeptidi quando prodotti da batteri Gram positivi, e da molecole organiche come i chinoloni e gli N-acil-omoserinlattoni se sintetizzati da batteri Gram negativi. In particolare, questa ultima classe di composti chimici, gli N-acil-omoserinlattoni, sono caratterizzati da un ciclo γ-lattone con una acetilazione sull’atomo di azoto in alfa e una catena acilica che può presentare idrossilazioni o ossidazioni ulteriori.
È stato dimostrato che alcuni batteri opportunisti per l’uomo, come lo Pseudomonas aeruginosa producono in maggiore quantità due particolari molecole QS di segnale, il N-(3-ossododecanoil)-L-omoserinlattone (3-oxo-C12-AHL) e il N-butanoil-L- omoserinlattone (C4-AHL). Insieme ad essi, un’altra classe di QS è stata identificata in questi batteri Gram-negativi opportunisti, e cioè quella dei chinoloni, in particolare la molecola 2-eptil-3-idrossi-4(1H)-chinolone (PQS o C7 HQ). I QS giocano un ruolo cruciale nella formazione del biofilm e sono noti per la capacità di legare la frazione del lipide A dei lipopolisaccaridi (LPS). Recenti studi hanno suggerito che QS possono inoltre interagire con cellule eucariote esercitando un effetto immunomodulante e giocando un ruolo chiave nelle infezioni del tratto urinario.
Le sostanze pro-infiammatorie (IL1 e TNF) insieme ai prodotti batterici LPS e soprattutto QS sono in grado di agire direttamente sull’equilibrio tra vasodilatazione e vasocostrizione causando disfunzione delle cellule endoteliali e delle cellule tubulari, infiltrazione leucocitaria e attivazione della cascata della coagulazione, tutti meccanismi coinvolti nella patogenesi della sepsi ed associati al coinvolgimento multi-organico tra cui AKI. Una diagnosi precoce del coinvolgimento multi-organico (multi-organ failure) in corso di sepsi non è semplice da effettuare e spesso la patologia viene diagnosticata tardivamente in assenza di bio-marcatori precoci di danno.
La presente iniziativa soddisfa quindi la necessità del medico di individuare e valutare quanto più precocemente possibile il decorso della patologia e attuare una terapia efficace e tempestiva, nell’ottica di evitare l’insorgenza di AKI.
La sepsi è una disfunzione d'organo pericolosa per la vita causata da una risposta disregolata dell'ospite all'infezione. Sepsi e shock settico sono i principali problemi sanitari, che colpiscono milioni di persone in tutto il mondo ogni anno (circa 1 vittima su 4 ricoveri). L’identificazione precoce e la gestione appropriata nelle prime ore dopo lo sviluppo della sepsi migliora la sopravvivenza dei pazienti. L’individuazione della fonte dell’infezione e dell’agente patogeno permettono di controllare la fonte e di utilizzare una terapia antibiotica mirata che risulti più efficace e riduca anche lo sviluppo di batteri resistenti agli antibiotici a seguito di un’esposizione prolungata a molecole ad ampio spettro.
La presente iniziativa si propone di valutare presenza e impatto di molecole QS in pazienti selezionati del territorio con riferimento ai ricoverati in terapia (sub)intensiva dell’ospedale Città della Salute e della Scienza della Città di Torino. Nell’ambito del presente progetto si intendono valutare molecole QS a livello ematico e urinario.
Il progetto si pone come primo obiettivo lo sviluppo e la messa a punto di un metodo analitico selettivo, sensibile e robusto per la determinazione di diverse classi di molecole QS in matrici biologiche quali plasma sanguigno e urina. La tecnica utilizzata sarà la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tramite ionizzazione a pressione atmosferica. Il team di ricerca interdisciplinare ha già messo a punto e pubblicato (F. Dal Bello et al., Anal. Bioanal. Chem. 413(3), 853–864) un metodo analitico per la ricerca di molecole QS in matrici batteriche. Il Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute di afferenza della PI Dal Bello ha in dotazione i beni strumentali e le attrezzature necessari per la realizzazione della presente iniziativa. Pur essendo tale tecnologia quella di elezione per l’analisi dei fluidi biologici, non sono al momento state sviluppate metodiche specifiche e validate in ambito clinico. Parte fondamentale e prioritaria sarà la valutazione della fase pre-analitica del processo, fase che permette la più alta resa di estrazione delle molecole di QS da matrici biologiche complesse. Quindi, passando al metodo HPLC, sarà importante valutare la migliore fase stazionaria per la separazione dei QS in matrici ricche di interferenti quali sono il plasma e l’urina. Anche i parametri di acquisizione di spettrometria di massa verranno ottimizzati per permettere la più sensibile rivelazione delle molecole in esame. Quindi il metodo analitico sviluppato verrà innanzitutto sottoposto a validazione in termini di selettività, sensibilità, accuratezza e precisione. L’applicabilità ai casi reali verrà determinata monitorando l’effetto matrice relativo ai fluidi biologici sull’accuratezza della misura analitica.
Successivamente il metodo analitico sviluppato verrà applicato a campioni biologici raccolti presso il reparto di terapia (sub)intensiva dell’ospedale Città della Salute e della Scienza della Città di Torino. Le azioni concrete che verranno poste in essere prevedono la raccolta dei fluidi biologici in campioni di pazienti adulti (≥ 18 anni) con shock settico secondo la definizione Sepsis 3. In breve, lo shock settico è definito come infezione sospetta o confermata, più iperlattacidemia e fabbisogno di noradrenalina per ipotensione persistente, dopo un carico di liquidi di almeno 1000 mL in un’ora. In tempi corrispondenti a 24, 48, 72 ore e 1 settimana dall’ingresso in terapia intensiva verranno prelevati campioni ematici ed urinari per la determinazione della quantità di molecole QS. Grazie al dosaggio delle molecole QS via spettrometria di massa si renderà possibile un’eventuale correzione della terapia antibiotica. L’esito di tale variazione terapeutica sarà valutato con l’analisi via spettrometria di massa nei diversi time points dei nuovi livelli di molecole QS. Quindi la valutazione del successo in ambito clinico considererà come outcome clinici la mortalità in terapia intensiva, la mortalità a 28, 60 e 90 giorni, l’incidenza di AKI in accordo alle classi KDIGO a 28, 60 e 90 giorni, i giorni liberi da ventilazione meccanica a 28, 60 e 90 giorni e infine i giorni liberi da terapia sostitutiva renale a 90 giorni.
L’iniziativa prevede l’ottenimento di risultati della ricerca che verranno divulgati sotto forma di pubblicazioni scientifiche su riviste “peer-reviewed”. Saranno anche proposte comunicazioni a congressi nazionali e internazionali e conferenze specifiche.
L’iniziativa proposta risponde al focus relativo alla costruzione di reti tra chimici di laboratorio e medici ospedalieri e circuiti, con un’attenzione particolare allo sviluppo del territorio e alle azioni in grado di razionalizzare l’utilizzo delle risorse.
In particolare i risultati scientifici ottenuti dall’attività di ricerca si propongono di mettere a disposizione l’analisi via spettrometria di massa delle molecole QS anche ad altri ospedali regionali ed extra-regionali riducendo così i costi degli screening clinici locali. La location scelta per le analisi di laboratorio è la nuova sede del Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute realizzata nell’ambito del recupero del cosiddetto “Scalo Vallino” è realizzata in base a concetti di architettura sostenibile e a basso impatto energetico.
Il progetto è caratterizzato dalla capacità di creare una proficua rete a livello territoriale sfruttando le diverse competenze chimico-analitiche e cliniche dei componenti. Grazie alla disponibilità della strumentazione e delle competenze del laboratorio dell’unità di spettrometria di massa, Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute dell’Università di Torino (Dal Bello / Medana) per la quantificazione di molecole di origine batteriche di interesse biologico e alle profonde conoscenze cliniche in ambito anestesiologico e nefrologico delle unità dell’Università degli Studi di Torino, Dipartimento di Scienze Chirurgiche (Fanelli) e dell’Università degli Studi del Piemonte Orientale, Dipartimento di Medicina Traslazionale (Cantaluppi), il progetto di propone di realizzare uno studio prospettico osservazionale sul territorio Piemontese dell’evolversi dello shock settico in danno renale acuto (Acute Kidney Injury AKI).
L’integrazione interdisciplinare delle attività della ricerca in campo chimico-analitico e delle azioni della pratica clinica è un bisogno fondamentale per l’individuazione di bio-marcatori molecolari. La spettrometria di massa è una tecnica potente e di alta significatività diagnostica che è recentemente stata introdotta in molteplici determinazioni diagnostiche in ambito clinico. A seguito di ricerche innovative condotte con l’utilizzo della spettrometria di massa, è stato possibile individuare e studiare le molecole QS che veicolano informazioni che i germi si scambiano e possono indurre danno renale acuto (Acute Kidney Injury AKI). I QS rappresentano un sistema di regolazione trascrizionale dipendente dalla densità cellulare e costituiti da due elementi: molecola segnale in grado di essere internalizzata a livello citoplasmatico e attivatore trascrizionale. Chimicamente i QS possono essere descritti come piccole molecole in grado di diffondere nei fluidi biologici e sono rappresentati da oligopeptidi quando prodotti da batteri Gram positivi, e da molecole organiche come i chinoloni e gli N-acil-omoserinlattoni se sintetizzati da batteri Gram negativi. In particolare, questa ultima classe di composti chimici, gli N-acil-omoserinlattoni, sono caratterizzati da un ciclo γ-lattone con una acetilazione sull’atomo di azoto in alfa e una catena acilica che può presentare idrossilazioni o ossidazioni ulteriori.
È stato dimostrato che alcuni batteri opportunisti per l’uomo, come lo Pseudomonas aeruginosa producono in maggiore quantità due particolari molecole QS di segnale, il N-(3-ossododecanoil)-L-omoserinlattone (3-oxo-C12-AHL) e il N-butanoil-L- omoserinlattone (C4-AHL). Insieme ad essi, un’altra classe di QS è stata identificata in questi batteri Gram-negativi opportunisti, e cioè quella dei chinoloni, in particolare la molecola 2-eptil-3-idrossi-4(1H)-chinolone (PQS o C7 HQ). I QS giocano un ruolo cruciale nella formazione del biofilm e sono noti per la capacità di legare la frazione del lipide A dei lipopolisaccaridi (LPS). Recenti studi hanno suggerito che QS possono inoltre interagire con cellule eucariote esercitando un effetto immunomodulante e giocando un ruolo chiave nelle infezioni del tratto urinario.
Le sostanze pro-infiammatorie (IL1 e TNF) insieme ai prodotti batterici LPS e soprattutto QS sono in grado di agire direttamente sull’equilibrio tra vasodilatazione e vasocostrizione causando disfunzione delle cellule endoteliali e delle cellule tubulari, infiltrazione leucocitaria e attivazione della cascata della coagulazione, tutti meccanismi coinvolti nella patogenesi della sepsi ed associati al coinvolgimento multi-organico tra cui AKI. Una diagnosi precoce del coinvolgimento multi-organico (multi-organ failure) in corso di sepsi non è semplice da effettuare e spesso la patologia viene diagnosticata tardivamente in assenza di bio-marcatori precoci di danno.
La presente iniziativa soddisfa quindi la necessità del medico di individuare e valutare quanto più precocemente possibile il decorso della patologia e attuare una terapia efficace e tempestiva, nell’ottica di evitare l’insorgenza di AKI.
La sepsi è una disfunzione d'organo pericolosa per la vita causata da una risposta disregolata dell'ospite all'infezione. Sepsi e shock settico sono i principali problemi sanitari, che colpiscono milioni di persone in tutto il mondo ogni anno (circa 1 vittima su 4 ricoveri). L’identificazione precoce e la gestione appropriata nelle prime ore dopo lo sviluppo della sepsi migliora la sopravvivenza dei pazienti. L’individuazione della fonte dell’infezione e dell’agente patogeno permettono di controllare la fonte e di utilizzare una terapia antibiotica mirata che risulti più efficace e riduca anche lo sviluppo di batteri resistenti agli antibiotici a seguito di un’esposizione prolungata a molecole ad ampio spettro.
La presente iniziativa si propone di valutare presenza e impatto di molecole QS in pazienti selezionati del territorio con riferimento ai ricoverati in terapia (sub)intensiva dell’ospedale Città della Salute e della Scienza della Città di Torino. Nell’ambito del presente progetto si intendono valutare molecole QS a livello ematico e urinario.
Il progetto si pone come primo obiettivo lo sviluppo e la messa a punto di un metodo analitico selettivo, sensibile e robusto per la determinazione di diverse classi di molecole QS in matrici biologiche quali plasma sanguigno e urina. La tecnica utilizzata sarà la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tramite ionizzazione a pressione atmosferica. Il team di ricerca interdisciplinare ha già messo a punto e pubblicato (F. Dal Bello et al., Anal. Bioanal. Chem. 413(3), 853–864) un metodo analitico per la ricerca di molecole QS in matrici batteriche. Il Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute di afferenza della PI Dal Bello ha in dotazione i beni strumentali e le attrezzature necessari per la realizzazione della presente iniziativa. Pur essendo tale tecnologia quella di elezione per l’analisi dei fluidi biologici, non sono al momento state sviluppate metodiche specifiche e validate in ambito clinico. Parte fondamentale e prioritaria sarà la valutazione della fase pre-analitica del processo, fase che permette la più alta resa di estrazione delle molecole di QS da matrici biologiche complesse. Quindi, passando al metodo HPLC, sarà importante valutare la migliore fase stazionaria per la separazione dei QS in matrici ricche di interferenti quali sono il plasma e l’urina. Anche i parametri di acquisizione di spettrometria di massa verranno ottimizzati per permettere la più sensibile rivelazione delle molecole in esame. Quindi il metodo analitico sviluppato verrà innanzitutto sottoposto a validazione in termini di selettività, sensibilità, accuratezza e precisione. L’applicabilità ai casi reali verrà determinata monitorando l’effetto matrice relativo ai fluidi biologici sull’accuratezza della misura analitica.
Successivamente il metodo analitico sviluppato verrà applicato a campioni biologici raccolti presso il reparto di terapia (sub)intensiva dell’ospedale Città della Salute e della Scienza della Città di Torino. Le azioni concrete che verranno poste in essere prevedono la raccolta dei fluidi biologici in campioni di pazienti adulti (≥ 18 anni) con shock settico secondo la definizione Sepsis 3. In breve, lo shock settico è definito come infezione sospetta o confermata, più iperlattacidemia e fabbisogno di noradrenalina per ipotensione persistente, dopo un carico di liquidi di almeno 1000 mL in un’ora. In tempi corrispondenti a 24, 48, 72 ore e 1 settimana dall’ingresso in terapia intensiva verranno prelevati campioni ematici ed urinari per la determinazione della quantità di molecole QS. Grazie al dosaggio delle molecole QS via spettrometria di massa si renderà possibile un’eventuale correzione della terapia antibiotica. L’esito di tale variazione terapeutica sarà valutato con l’analisi via spettrometria di massa nei diversi time points dei nuovi livelli di molecole QS. Quindi la valutazione del successo in ambito clinico considererà come outcome clinici la mortalità in terapia intensiva, la mortalità a 28, 60 e 90 giorni, l’incidenza di AKI in accordo alle classi KDIGO a 28, 60 e 90 giorni, i giorni liberi da ventilazione meccanica a 28, 60 e 90 giorni e infine i giorni liberi da terapia sostitutiva renale a 90 giorni.
L’iniziativa prevede l’ottenimento di risultati della ricerca che verranno divulgati sotto forma di pubblicazioni scientifiche su riviste “peer-reviewed”. Saranno anche proposte comunicazioni a congressi nazionali e internazionali e conferenze specifiche.
L’iniziativa proposta risponde al focus relativo alla costruzione di reti tra chimici di laboratorio e medici ospedalieri e circuiti, con un’attenzione particolare allo sviluppo del territorio e alle azioni in grado di razionalizzare l’utilizzo delle risorse.
In particolare i risultati scientifici ottenuti dall’attività di ricerca si propongono di mettere a disposizione l’analisi via spettrometria di massa delle molecole QS anche ad altri ospedali regionali ed extra-regionali riducendo così i costi degli screening clinici locali. La location scelta per le analisi di laboratorio è la nuova sede del Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la Salute realizzata nell’ambito del recupero del cosiddetto “Scalo Vallino” è realizzata in base a concetti di architettura sostenibile e a basso impatto energetico.