Unraveling The moonLIghtinG AcTivity of the PFKFB bIfunctiOnal eNzyme with phospholipase C-gamma (LIGATION)

CONTESTO SCIENTIFICO La glicolisi funge da fonte di energia attraverso la conversione del glucosio in piruvato, che poi alimenta la fosforilazione ossidativa mitocondriale. In alternativa, quando la pO2 è bassa, il piruvato viene ridotto a lattato e in alcune cellule questa glicolisi anaerobica è sorprendentemente sufficiente a supportare circa l’80% della sintesi di ATP. A sorvegliare il flusso glicolitico c’è la 6-fosfofrutto-2-chinasi (PFK)/fruttosio 2,6-bisfosfatasi (FB), che catalizza sia la sintesi che la degradazione del fruttosio-2,6-bisfosfato, l’attivatore allosterico di PFK1. La famiglia PFKFB contiene quattro membri codificati da geni specifici (PFKFB 1–4). I PFKFB sono costituiti da omodimeri e ciascun monomero contiene sia domini fosfatasi che chinasi. Tra i PFKFB, PFKFB3 è espresso in modo ubiquitario, è sovraregolato in risposta a stimoli mitogeni, infiammatori e ipossia e mostra un rapporto chinasi/fosfatasi costantemente elevato. Inoltre, dati recenti indicano che PFKFB3 ha ruoli esterni alla glicolisi (regolazione del ciclo cellulare, impegno cellulare, traffico endoplasmatico, autofagia). Infine, durante la formazione del letto vascolare, PFKFB3 controlla la dinamica del citoscheletro e delle giunzioni aderenti con meccanismi apparentemente non solo mediati dalla produzione di ATP. RISULTATI PRELIMINARI UniTo ha precedentemente riportato il ruolo essenziale di una tirosina fosfatasi che prende di mira il PLCgamma attivato (PLCg) nelle cellule endoteliali (EC) in cui la tirosina chinasi VEGR2 era stimolata dal suo ligando affine VEGF (10.1182/blood-2011-11-390666). Eseguendo uno screening dell'interferenza mediata da RNA su scala genomica delle fosfatasi umane nelle EC, UniTo ha identificato PFKFB3 come un nuovo regolatore della fosforilazione di PLC mediata da VEGF. PFKFB3 è in grado di riconoscere il fosfo-PLCg come substrato e di rilasciare la porzione fosfato da Tyr783 fosforilato, necessaria per l'attivazione del PLC. Il test del ligando di prossimità eseguito su EC stimolato da VEGFA suggerisce la formazione di complessi tra PFKFB3 e PLC confermata dall'analisi computazionale sfruttata sulle strutture 3D disponibili risolte mediante cristallografia a raggi X. È interessante notare che un'analisi comparativa di PFKFB3 con altre fosfatasi proteiche ha mostrato che condivide una porzione significativa del suo motivo catalitico con la famiglia dell'istidina fosfatasi – ramo 2, avente un pTyr come substrato. OBIETTIVI LIGATION mira a comprendere il significato biologico e le caratteristiche molecolari dell'attività fosfatasi di PFKFB3 su PLCg. Obiettivi specifici sono: 1: analizzare i parametri biochimici e cinetici dell'attività della fosfatasi PFKFB3 su PLC 2: eseguire l'analisi strutturale del complesso PFKFB3-PLCg 3: studiare se l'attività non canonica osservata di PFKFB3 è limitata all'asse VEGFA/VEGFR2 o ha un significato più generale che regola altre vie di segnalazione 4: analizzare l'impatto del complesso PFKFB3-PLCg sul flusso glicolitico nelle EC